Bioinformatics

1.链特异性的基本知识

• http://www.genek.tv/article/27
• http://databeauty.com/blog/opinion/2016/09/21/RNA-seq-strand-issues.html

在建库的时候,选择的建库方法可以是链特异性的,链特异性的文库可以清楚地分出reads的方向是否与转录本相同;常用的链特异性文库方法是基于dUTP的方法.

质控的方向

就平常的生物实验而言，质控是要贯穿到实验的各个阶段的，比如那些阳性阴性对照就可以认为是在进行质控了。而在测序数据的分析过程中，也同样需要将质控贯穿到分析的各个阶段。质控基本上可以分为三个阶段，依据你的分析对象和分析目的不同而有所变化：raw sequence data, alignment, variant calling. 目前比较常见的质控多是局限在raw data的质控这个阶段。虽然如此，另外两个阶段的质控也应该是需要的，因为后续的许多分析也是基于这两个阶段。Raw data 质控的方向通常有以下几类：quality trimming, adapter removal, contaminant filtering. 而在alignment阶段，我们可以通过uniquely mapped reads, signed noise ratio 进行质控。在variant calling阶段，还在调查中……

https://pachterlab.github.io/eXpress/downloads/express-1.5.1/express-1.5.1-linux_x86_64.tgz

使用方法

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express [options]* <target_seqs.fasta> <aligned_reads.(sam/bam)>

# <target_seqs.fasta>:	参考序列的fasta文件
# <aligned_reads.(sam/bam)>:	比对结果文件
# -o path: 	指定输出路径
# -B n:	指定进行batch EM rounds计算的次数,以时间为代价提高定量准确性
# -O n:	指定进行online EM rounds计算的次数,以时间为代价提高定量准确性
# -m n:	指定fragment的平均长度
# -s n：指定fragment长度的标准差
# -H str:	以逗号分隔的位置坐标,指定haplotypes的位置。利于等位基因的特异表达定量
# --output-align-samp:	
# --output-align-prob:
# --fr-stranded: 指定链特异性比对的方向,read1比对到forward链,read2比对到reverse链
# --rf-stranded：指定链特异性比对的方向,read1比对到reverse链,read2比对到forward链
# --f-stranded:	 single-end, read比对到forward链
# --r-stranded:	 single-end, read比对到reverse链
#

输入文件

eXpress需要一个multi-fasta格式的输入文件,计算该文件序列的转录丰度。

免比对的定量：kallisto

kallisto是一个align-free的测序结果定量工具。速度快得很.他可以在10min内完成index的构建，然后花3min完成30 million的human reads的定量。它不仅快速而且准确。

Pseudoalignment保存了用于定量的关键信息。An important feature of kallisto is that it outputs bootstraps along with the estimates of transcript abundances

一、芯片基础

1.1 芯片平台和包

stringTie 是用于 RNA-seq 的转录本组装和定量软件

测序数据的质控是必须的，也是主要的。

在生信分析中，我们通常接触的都是下机数据，也就是测序的结果数据，但是这些数据是怎么产生的呢？这就要讲到测序的原理。其实，测序的本质原理就是DNA链的合成咯，通过合成新的 DNA 链我们从而知道 DNA 链的序列组成。一代测序的 sanger 法是通过每步添加一种特定标记的双脱氧核糖核苷酸( ddNTP )来合成 DNA 链，由于 ddNTP 会导致 DNA 链合成的中断，那就可以得到各个长度大小的 DNA 片段，通过跑胶分离则可知道不同DNA长度的链上分别是什么标记，由此知道其标记对应的 ddNTP，从而推出 DNA 的序列组成；这类一代测序法过程比较耗时。而二代测序的改进在于，它是边合成边测序的，无需后续的跑胶等实现；DNA 合成的数量巨大，也就使得测序过程也更为快速。在如今市场上，二代测序虽然说有许多平台，如 Illumina，Roche 454、Ion Torrent，但市场上一直是 Illumina 占据主导地位。所以我们这里将说明一下 Illumina 的测序过程。