未来为你而来

subread是个套件,里面有subread aligner, subjunc aligner, featureCounts, exactSNP.

subread aligner可以用于DNA-seq和RNA-seq.当用于RNA-seq时,subread只适用于差异分析;对于检测基因组变异如可变剪接之类的,需要reads的完全比对,这时候可以使用subjunc进行比对.在比对RNA-seq数据时,subread不会取检测exon-exon junctions的存在,只会把exon-spanning eads的最大可比对区域作为比对结果.但是,如果只是进行差异分析的话,subread的结果足以进行.subread的比对上reads可能会比subjunc多.

在生信分析中，我们通常接触的都是下机数据，也就是测序的结果数据，但是这些数据是怎么产生的呢？这就要讲到测序的原理。其实，测序的本质原理就是DNA链的合成咯，通过合成新的 DNA 链我们从而知道 DNA 链的序列组成。一代测序的 sanger 法是通过每步添加一种特定标记的双脱氧核糖核苷酸( ddNTP )来合成 DNA 链，由于 ddNTP 会导致 DNA 链合成的中断，那就可以得到各个长度大小的 DNA 片段，通过跑胶分离则可知道不同DNA长度的链上分别是什么标记，由此知道其标记对应的 ddNTP，从而推出 DNA 的序列组成；这类一代测序法过程比较耗时。而二代测序的改进在于，它是边合成边测序的，无需后续的跑胶等实现；DNA 合成的数量巨大，也就使得测序过程也更为快速。在如今市场上，二代测序虽然说有许多平台，如 Illumina，Roche 454、Ion Torrent，但市场上一直是 Illumina 占据主导地位。所以我们这里将说明一下 Illumina 的测序过程。

RSEM利用的是transcripts而非genome。我们有两种方式来构建RSEM转录参考，其一是利用参考基因组来构建；另外一种方式是从许多转录本中构建。

下方的代码把edgeR的三种差异分析整合成一个函数, 调用时直接指定参数即可.

• classcial
• glm: likelihood ratio test/ quasi-likelihood F-test
• • quasi-likelihood(qlf): 推荐用于差异分析，因为他对错误率限制较好。
• • likelihood(lrt)：对与单细胞RNA-测序和没有重复的数据较好

首先呢,要详细了解的话,需要看这篇文献(Ten Years of Pathway Analysis: Current Approaches and Outstanding Challenges),他把基本的信号通路分析方法进行了总结.

与DESeq类似的包有：edgeR、limma、DSS、EBSeq、baySeq

一、核心逻辑代码

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

# countData: 以样品为列名,基因为行名的表达矩阵
# colData的形式: 以样品作为行名,列是样品对应的分组类型
# 生成count matrix
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = cts,
                              colData = coldata,
                              design = ~ batch + condition)
# 生成DESeq数据集
dds <- DESeq(dds)
# 进行比较，获得结果
res <- results(dds, contrast=c('condition', 'treat', 'ctrl'))
resultsNames(dds)
res <- lfcShrink(dds, coef=2)

#  DESeqDataSetFromTximport:   由Salmon, Saifish, kallisto生成
#  DESeqDataSetFromHTSeq:      由htseq-counts生成
#  DESeqDataSet:               由RangedSummarizedExpriment生成

ID 类型

在说duplication之前,我们有必要说一下PCR bias和unique reads. PCR bias是指在PCR扩增的过程中,PCR引物会偏好性地同某条DNA链结合,导致的结果就是这条DNA链被扩增的数目要更多;而不是所有的DNA链被平行扩增.那么什么又是unique reads呢?在得到测序结果后,对于任意两条reads,只要其reads的起点,中间序列,终点这三点有一点不同,这两条reads就是互为unique reads. 所以我们来看, 建库后PCR扩增的测序结果里面,肯定有很多条reads不是unique reads,这些reads就是所谓的duplication, 这其中肯定也包含了PCR bias引起的额外重复.

1.Sam文件各标签含义（tophat/hisat2)

• NH:i:: N=1时 为unique。常用于tophat/hisat2产生的sam文件unique read筛选。
• CC:Z: 当为‘=’为map到同一条基因上，一般在map基因组时由于内含子存在而容易出现，他只代表两种不同的方式，计数时应记为1。此处一般为其他基因的名字。CP:i 和HI：i标签为map到第i条基因及起始位置。
• YT:Z:S 代表的含义与bowtie产生的sam也不同。具体还未知！其他标签AS，XN,XM,XO,XG,NM,MD等如下图可以看出都相同。

三大数据库版本对应情况