生信基础

一、 基础概念

• edgeR
• DESeq2
• GFOLD

ID 类型

在说duplication之前,我们有必要说一下PCR bias和unique reads. PCR bias是指在PCR扩增的过程中,PCR引物会偏好性地同某条DNA链结合,导致的结果就是这条DNA链被扩增的数目要更多;而不是所有的DNA链被平行扩增.那么什么又是unique reads呢?在得到测序结果后,对于任意两条reads,只要其reads的起点,中间序列,终点这三点有一点不同,这两条reads就是互为unique reads. 所以我们来看, 建库后PCR扩增的测序结果里面,肯定有很多条reads不是unique reads,这些reads就是所谓的duplication, 这其中肯定也包含了PCR bias引起的额外重复.

1.Sam文件各标签含义（tophat/hisat2)

• NH:i:: N=1时 为unique。常用于tophat/hisat2产生的sam文件unique read筛选。
• CC:Z: 当为‘=’为map到同一条基因上，一般在map基因组时由于内含子存在而容易出现，他只代表两种不同的方式，计数时应记为1。此处一般为其他基因的名字。CP:i 和HI：i标签为map到第i条基因及起始位置。
• YT:Z:S 代表的含义与bowtie产生的sam也不同。具体还未知！其他标签AS，XN,XM,XO,XG,NM,MD等如下图可以看出都相同。

三大数据库版本对应情况

与DESeq类似的包有：edgeR、limma、DSS、EBSeq、baySeq

一、核心逻辑代码

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# countData: 以样品为列名,基因为行名的表达矩阵
# colData的形式: 以样品作为行名,列是样品对应的分组类型
# 生成count matrix
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = cts,
                              colData = coldata,
                              design = ~ batch + condition)
# 生成DESeq数据集
dds <- DESeq(dds)
# 进行比较，获得结果
res <- results(dds, contrast=c('condition', 'treat', 'ctrl'))
resultsNames(dds)
res <- lfcShrink(dds, coef=2)

#  DESeqDataSetFromTximport:   由Salmon, Saifish, kallisto生成
#  DESeqDataSetFromHTSeq:      由htseq-counts生成
#  DESeqDataSet:               由RangedSummarizedExpriment生成

Fastq和Fasta格式

FASTA

Fasta格式是存储序列相关信息的一种格式，包含两个部分。Fasta第一个部分是以“>”开头的一行。以序列来源、序列ID为值对，用竖线“|”进行分隔。在最后竖线处，以空格分开，添加序列相关描述。第二部分是序列的详细信息，多数为序列组成。其基本形式如下：

1
2

>ENSEMBL|geneID|source2|geneID description
序列ATCG

1.链特异性的基本知识

• http://www.genek.tv/article/27
• http://databeauty.com/blog/opinion/2016/09/21/RNA-seq-strand-issues.html

在建库的时候,选择的建库方法可以是链特异性的,链特异性的文库可以清楚地分出reads的方向是否与转录本相同;常用的链特异性文库方法是基于dUTP的方法.

质控的方向

就平常的生物实验而言，质控是要贯穿到实验的各个阶段的，比如那些阳性阴性对照就可以认为是在进行质控了。而在测序数据的分析过程中，也同样需要将质控贯穿到分析的各个阶段。质控基本上可以分为三个阶段，依据你的分析对象和分析目的不同而有所变化：raw sequence data, alignment, variant calling. 目前比较常见的质控多是局限在raw data的质控这个阶段。虽然如此，另外两个阶段的质控也应该是需要的，因为后续的许多分析也是基于这两个阶段。Raw data 质控的方向通常有以下几类：quality trimming, adapter removal, contaminant filtering. 而在alignment阶段，我们可以通过uniquely mapped reads, signed noise ratio 进行质控。在variant calling阶段，还在调查中……